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文｜动脉新医药

近几年，细胞与基因治疗因其惊人的疗效，被大众寄予厚望。同样，细胞与基因治疗背后的核心底层技术——基因编辑工具，也在近年开始浮出水面，被越来越多的企业和资本重视。

2022年2月28日，美国专利和商标局（USPTO）裁定，张锋所在的博德研究所团队继续拥有在真核细胞中使用CRISPR基因编辑工具的专利。“诺奖（以Jennifer和Emmanuelle为代表的团队）团队”又一次输掉了这场长达近10年的知识产权争夺。针对上述结果，Jennifer团队表示将会提起上诉，看来这场长达10年的专利角逐还远未结束。

作为医疗行业观察者，动脉新医药也在时刻关注基于CRISPR技术的新一代基因编辑工具。对此，我们采访了国内数家基因编辑工具开发/细胞与基因治疗企业，听听业内科学家们的看法。接下来，你将了解到：

1.作为目前使用最广泛的基因编辑工具，CRISPR/Cas9是否存在技术短板？

2.基于CRISPR/Cas9的优化，是否为锦上添花？一旦出现专利垄断，此前的努力会功亏一篑吗？

3.针对基因编辑工具技术，国内团队偏向于技术优化还是底层技术的创新？

4.针对近几年较热的CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13，它们的专利布局如何？国内企业为何可以在短期内就做出创新性成果？

5.为何大部分企业针对基因编辑工具的开发和优化都十分“低调”，从不宣传？投资机构更看重产品进展还是底层技术？

6.未来，基因编辑工具会朝着哪些趋势开发和优化？国内和国外还存在多少差距？

01 脱靶、安全、编辑效率，都不是痛点

根据公开资料，我们可以很轻易的归纳出CRISPR/Cas9基因编辑工具本身存在以下几个痛点：

1、潜在的脱靶风险（脱靶的检测与控制）。对于潜在的脱靶风险的控制，科研团队在设计基因编辑工具时，可尽量避免有相似的序列，以免造成序列依赖性。基于此进行严格的脱靶验证，就可最大程度避免该风险。

2、切割基因组DNA序列所导致的潜在安全性风险。在此过程中，如果发生了DNA双链断裂，可能会引起DNA大片段的缺失，或染色体结构的变化。但通常情况下，大片段的缺失和染色体的异常变化都会导致细胞不容易存活。目前，尚未报道过相关的安全事件，所以这一问题暂时还没有影响基因编辑在产业端的应用推进。

3、对PAM序列的要求，限制了其在基因组上的可编辑范围。在CRISPR/Cas9靶向DNA进行编辑时，可以实现DNA双链的断裂。在此基础上，如果再加上相关的转录因子，则可以实现某些基因的转录调控。但这些基因的靶向位点会受到PAM序列的限制，从而不能让基因编辑实现“指哪打哪”的魔力。

4、体内递送系统的设计和搭配。CRISPR/Cas9作为一个基因编辑工具，如何跟体内的递送系统进行有效的搭配，同时保持本身的编辑能力和成药能力，也是一个需要不断被优化的点。目前CRISPR/Cas9分子量较大，在进行体内基因治疗需要AAV进行递送时，AAV装载量的限制，就要求基因编辑工具的尺寸进一步微型化。

总体来说，不仅是CRISPR/Cas9，所有的CRISPR/Cas蛋白家族或多或少都有自己的优点和不足。没有任何一个CRISPR/Cas基因编辑工具可以完全覆盖所有的应用场景，如果将CRISPR/Cas9用于敲除某个基因，它已经足够优秀。只要能够做到“术业有专攻”，将基因编辑工具用于合适的领域，便可以让其“发光发热”。

02 锦上添花or功亏一篑？

国内团队基于专利技术被国外垄断的CRISPR/Cas9基因编辑工具的优化，是否为锦上添花？一旦出现专利垄断，此前的努力会功亏一篑吗？

在讨论这个问题前，我们需要缕清CRISPR/Cas9的发展之路，和伴随发展延续至今的专利之争。

2012年8月，Jennifer团队在《Science》合作发表了CRISPR/Cas9领域的里程碑论文；2013年2月，张锋团队也在《Science》发表了论文，文章原始数据表明其相关实验早于Jennifer团队。2014年，美国专利商标局率先批准了张锋团队所在的博德研究所的专利请求。在此后多次诉讼中，因Jennifer团队证据不足，张锋团队屡占上风，特别是最具商业价值的、用于哺乳动物的基因编辑工具专利被张锋团队牢牢攥在手中。

2020年10月，诺贝尔评奖委员会公布化学奖获奖名单，Jennifer和Emmanuelle获得殊荣，原因是她们开发了基因编辑工具CRISPR/Cas9。张锋“痛失诺奖”，引发热议。今年2月28日，美国专利和商标局裁定，张锋所在的博德研究所团队拥有在真核细胞中使用CRISPR基因编辑工具的专利。“诺奖”团队暂时输掉了此次对于知识产权的争夺，但这场超过10年的专利角逐还远未结束。

对于CRISPR/Cas9的专利属权一直争议不断，但很明确的是，CRISPR/Cas9的专利技术基本属于国外。

“任何一种技术，在发展早期都具有待突破的瓶颈。对于技术发明人，他们也需要解决这些瓶颈，才能真正的实现技术在产业化端的成功应用。如果国内的团队基于CRISPR/Cas9技术的优化足够重大，以至于国外团队也需要用到我们的‘锦上添花’，就有可能通过专利交叉许可解决技术的专利垄断问题。”邦耀生物联合创始人兼副总裁李大力博士告诉动脉新医药。

“一般企业在立项时就会考虑关键技术的IP属性这一问题。我们可以看到，CRISPR/Cas9专利权人在全球范围内都向很多企业提供了商业化授权许可，包括技术服务和药物开发等各个方向。企业需要向专利持有方支付授权费或达成授权许可协议，便可以应用相关技术。另一方面，CRISPR/Cas9技术也在持续创新和改进，衍生的这些技术也能产生巨大的商业价值。”瑞风生物创始人梁峻彬博士告诉动脉新医药。

关于转让或许可技术给其他公司进行开发，从而带来收益，相关的例子并不缺乏。例如日本微生物组基因编辑疗法公司Bio Palette从神户大学获得了使用nickase Cas9进行单碱基编辑的专利的许可，做了一系列创新并获得了收益，这一技术就属于对CRISPR/Cas9技术的优化。再例如Bio Palette与Beam公司就碱基编辑技术进行了交叉许可（获得Beam许可），Bio Palette因此从中获益。

“在工业界，美国的基因编辑企业在成立之初就会优先考虑其底层IP是否清晰。对于国内的早期企业而言，依靠团队或平台优势就能够获得资本和市场的认可。随着企业的发展，基于技术优化的一定积累，开发原始创新的技术更有利于促进企业长远和自由发展。”辉大基因创始人兼CEO姚璇博士告诉动脉新医药。

基于业内人士的认知，我们不妨看得更“开”。如果一项技术确实具有重大的价值，那它其实很难被个别机构所垄断。这种垄断只会埋没高技术的价值，不利于其科研和商业价值的放大。不管在学术界还是产业界，都需要大量的持续创新才会使得这个技术的本身的社会价值和商业价值越来越大。

03 技术优化or底层创新？

尽管国内大多企业认为基于CRISPR/Cas9的技术优化并不会出现功亏一篑的情况。但是当动脉新医药问及企业目前偏向于基于国外专利技术进行优化还是自主研发实现底层创新时。企业们还是“口嫌体正直”的统一选择了更为艰难的底层创新。

李大力博士说道：“邦耀生物做了许多碱基剪辑器的开发，并在2020年就开发了一系列超高活性的新型胞嘧啶碱基编辑器（命名为：hyCBE），相关成果已在线发表于Nature Cell Biology。

至今，它仍然是活性最高的胞嘧啶碱基编辑器（最高可提升20倍活性），其编辑窗口较传统编辑器也有明显扩增，能编辑到更多的位点。更重要的是，这种改造方法具有兼容性，它不仅适用于改造胞嘧啶碱基编辑器，其他碱基编辑器同样适用于这个方法，在基因治疗等领域已展示出非常广阔的应用前景。

同年6月，邦耀生物团队又在国际著名学术期刊Nature Biotechnology发文，开发出全新的双碱基编辑系统，这项成果不仅是碱基编辑工具开发领域的又一重大突破，也为基础研究和遗传性疾病如β-地中海贫血的治疗提供了新的发展方向和工具。针对上述提到的碱基编辑器，邦耀生物已申请了多项专利，并进行了全球化布局。”

梁峻彬博士说道：“瑞风目前针对CRISPR/Cas系列工具酶进行了开发。在Cas13方面我们率先进行了专利布局。瑞风开发的新型蛋白对特定RNA靶核酸的编辑活性优于目前最常用的高活性CasRx，且脱靶效应更低。

其中一高活性Cas13的尺寸比CasRx小约70aa，更有利于AAV递送，在成药上具有极大的优越性。此外，新的Cas12亚型也是瑞风正在开发的方向。我们还对某些Cas12蛋白进行了工程化改造，目前也已经取得了不错的成果，显著提高了野生型参比蛋白的活性，且不受Cas12亚型专利壁垒限制。”

姚璇博士说道：“辉大科学家团队在2020年通过数据计算分析开发了两类新型CRISPR/Cas13 RNA编辑系统，2021年在《Nature Methods》发表了相关文章，介绍了我们如何在不同的数据库中筛选蛋白，进而获得高的RNA编辑器。

这两年间，我们对Cas13进行了许多改造和优化，得到了特异性强、脱靶性低的高保真版本hf-Cas13蛋白，在动物实验中已经取得了积极的有效性和安全性试验数据。Cas12Max是辉大子品牌HuiEdit科学家团队在去年开发的新型DNA编辑器，目前经过优化后的Cas12蛋白在体外和体内都能实现与spCas9相当的DNA编辑效率。同时，团队还在继续优化其PAM识别区，以进一步扩大Cas12的靶向序列范围。针对CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，辉大均已申请相应的全球专利，并做了底层专利的布局。基于这些成果，辉大正在积极和国内外多家企业洽谈专利许可、联合开发等相关合作。”

为何国内的基因编辑企业们会在近几年频频爆出底层技术的创新？究其原因，主要有三。

其一，在CRISPR/Cas9基因编辑工具技术刚刚面世时，不管是企业还是科研机构，都还处于了解和学习的历程。那时候国内的团队们本身对新工具的认知还处于不断深化和积累的状态，只能对底层技术进行优化。这一阶段对应国内的2013年至2018年，属于CRISPR/Cas9基因编辑工具技术在国内发展的第一个五年。

其二，在积累到足够经验时，国内的团队基于此前优化的创新点得出通用的底层逻辑，或者是开发基因编辑工具的相关经验。通过技术迁移或者是技术兼容，初步探索新型基因编辑工具。该阶段对应国内的2018年至今。

其三，纵观整个基因编辑工具的发展历史，我们可以发现人类对于自然界微生物的了解还是冰山一角。仍然有大量的编辑工具可以持续不断的发掘。沿着高度优化或原创性技术开发的方向前进，就能一直对现有基因编辑工具进行局部创新和迭代创新。

关于基因编辑工具的底层创新，其实国内企业早就有所布局。近几年，关于CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13基因编辑技术的相关成果频频爆出。在众多的家族蛋白中，为何会是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13率先“出圈”？其实这并没有什么特定的原因。

这主要由于，相比于CRISPR/Cas9“密不透风”的专利保护范围，CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13具有巨大的专利布局空间。

从基因编辑工具本身来讲，CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13与CRISPR/Cas9都使用了Cas家族蛋白，相关工具也都具有简便、高效的优点（相比于ZFN、TALEN技术）。一些CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13系统相比于CRISPR/Cas9还具有尺寸更小便于AAV和质粒递送、PAM差异化序列、无需tracrRNA、编辑策略设计灵活等差异特性。

此外，CRISPR/Cas13基因编辑工具靶向RNA，提供了RNA水平的一种编辑手段，具有高度的靶向特异性，在非遗传性疾病的药物开发方面具有巨大的商业价值。这与CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12作用在DNA水平的成药策略是不一样的。CRISPR/Cas13其中的RNA敲降成药策略方面与化学修饰小核酸的作用类似，后者是基于化学合成路线的原理。业内人士认为，CRISPR/Cas13RNA编辑工具的应用，在未来也将会找到独具优势的适应症或者应用场景。

总体来说，Cas家族蛋白的真正应用，一般需要挖掘发现和序列优化：

首先，要在TB级的丰富数据库中，通过AI、生物信息学、蛋白质结构学等综合分析，找寻潜在功能性蛋白。

其次，要在野生型的蛋白基础上进行各种序列的优化，改造和修饰。对于已经发现的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13等家族，野生型蛋白都有一定的局限性，科学家也是对它们的序列进行优化和改造，来提高它们的编辑效率、PAM序列识别区域、特异性以及降低脱靶效应、优化编辑工具的大小等。

04 投资机构还需被“教育”

底层技术和产品管线同等重要。

通过上述篇幅，我们能够看出基因编辑工具就像是细胞与基因治疗行业的奠基石，只有不断的开发和优化基因编辑工具，细胞与基因治疗产业才能走得更远。但是我们也能发现一个现象，国内大部分企业针对基因编辑工具的开发和优化都十分“低调”，从不宣传。造成这一现象的原因有三：

首先，每家企业都有自己的形象定位和宣传的偏向性。对于宣传基因编辑工具，还是细胞与基因治疗管线，企业选择自由。

其次，大部分该领域的企业覆盖到产业端时，大家可能更倾向于将显性的药品本身的里程碑进展对外进行宣传，从而增强企业的品牌影响力和对投资人的吸引力。

再而，要想做到真正的底层创新，并不是一件易事。例如针对CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13的开发，目前一般都是先筛选野生型Cas12/Cas13蛋白，但野生型蛋白一般难以兼顾用作药物治疗时的安全性、有效性、免疫原性、脱靶等，而需要做一定的工程化改造。能做到这类工作的国内企业少之又少。尤其是大部分初创企业，在资金和人才的双重匮乏下，没有进行底层创新的实力和时间。大多数企业会选择在推进管线研发的过程中，顺便做一些技术创新。

未来，新型的CAS蛋白或者是基于现有CAS蛋白的开发和优化，大体会朝着活性更高、脱靶风险更小、PAM识别范围更广、尺寸更小、分子组合应用创新等方向发展。

另一方面，在欧美生物医药行业，初创企业可以轻松凭借一个新的蛋白或一项新的技术，得到投资人的认可，从而获得不菲的融资。从国内投资现状来讲，大部分投资人则更看重药物本身的进展。在这一点上，国内的投资人还需要被持续教育：底层技术是公司未来发展的基石。

随着行业的不断向前，投资人们也在不断接受新知识的洗礼。越来越多的在关注产品时，也会特别关注一些具有真正含金量技术的药物研发企业。虽然不同的投资人判断产品和技术的权重比例不同，但是这两者之间本身就是相辅相成的关系。产品是成功技术的体现和放大，技术是产品研发的根基和后盾。