文 | 追问nextquestion

人类大脑具有极低的能耗，却可以完成庞大的计算过程。要理解其中的原理，就需要深刻理解大脑神经元之间的突触连接、空间结构和神经回路的静态网络以及基于在此基础上的动态认知过程。这些任务远远超过了传统的大脑脑区功能学研究的范畴。连接组学（Connectomic）研究旨在通过精确绘制每个细胞如何与其他细胞进行连接，从而实现上述目的。

随着科学研究的深入，尤其是在计算和数据处理能力的飞速提升下，对神经系统的研究方法也正在发生变革。在这一背景下，像谷歌这样的科技巨头也开始投入到这一领域，将先进的技术应用于神经科学研究，推动了连接组学的快速发展。目前，科学家已经绘制了多种生物大脑的连接方式的详细图谱，这些成果正在快速改变我们对大脑工作方式的理解。

十年前，谷歌开始对人工智能的创新和与大型数据集的合作感兴趣，并成立了连接组学团队。在重构大脑结构的过程中，它们产生了海量的数据，为了有效处理连接组学研究中产生的海量数据，谷歌团队开发了flood-filling networks（FFN）模型^[1]，以取代手动在图像上进行细胞上色的传统方式。这些网络可以通过组织层自动重建神经元。在此基础上，谷歌开发了SegCLR算法^[2]，可自动识别这些网络中细胞的不同部分和细胞类型。谷歌连接组学团队还开发了TensorStore^[3]，一个开源的C++和 Python软件库，用于存储和管理大量多维数据集。这个工具已经实现了远远超出连接组学的功能，现在在谷歌和更广泛的机器学习社区中广泛使用。

在2018年，谷歌与德国马克斯普朗克神经生物学研究所合作，开发了一种基于深度学习的系统，可以自动映射大脑的神经元^[1]。他们对100万立方微米斑胸草雀大脑扫描图像进行了重建。

▷利用FFN对斑胸草雀大脑一小部分的每个神经元进行分割处理示意图。图源：google

2019年，谷歌与霍华德•休斯医学研究所以及剑桥大学合作，通过FFN模型和TPU芯片，将果蝇大脑切分成数千个40纳米的超薄切片，并且使用透射电子显微镜生成每个切片的图像，产生了40万亿像素以上的果蝇大脑影像，然后将2D图像排列对齐形成完整果蝇大脑的3D图像^[4]。2020年，谷歌发布了果蝇半脑连接组，绘制的图像涵盖了25000个神经元并揭示其神经元之间的连接关系，按体积计算，大约占果蝇大脑的三分之一^[5]。

▷果蝇半脑连接组。

近日，谷歌与哈佛大学的Lichtman实验室合作，在Science杂志上发表了一篇名为“纳米级分辨率下重建的千兆像素人类大脑皮层片段”（A petavoxel fragment of human cerebral cortex reconstructed at nanoscale resolution）的文章。

▷Shapson-Coe, Alexander, et al. "A petavoxel fragment of human cerebral cortex reconstructed at nanoscale resolution." Science 384.6696 (2024): eadk4858.

该研究发布了最新的H01数据集，这是一个1.4 PB的人类脑组织小样本渲染图。H01样本通过连续切片电子显微镜以4nm分辨率成像，再通过自动计算技术重建和注释，最后揭示了初步的人类大脑皮层结构（图1）。H01不仅是迄今为止在这种程度上所有生物中对大脑皮层进行成像和重建的最大样本，也是首个大规模研究人类大脑皮层的突触连接性的样本，这种连接性跨越了大脑皮层中所有层面的多种细胞类型。

▷图1：人脑皮层H01数据集。

为了创建这张图像，研究团队遇到了许多障碍。一个主要的问题是找到适合的脑组织样本。由于人类大脑在死后会迅速开始退化，尸体的大脑组织往往难以用于研究。因此，研究小组选择了在脑部手术期间从一名癫痫患者脑内取出的一块组织，该手术旨在帮助控制癫痫发作。此外，要想在突触水平上识别神经环路的结构，需要更高分辨率的电子显微镜。Serial EM凭借其自动化与快速成像能力能够以纳米分辨率对立方毫米体积的组织成像，成为重构人脑精细神经环路的有力工具。

这项工作的成果主要包括以下四个方面：

人脑样本重建与神经元连接重建

该研究使用的人脑样本为癫痫患者在进行脑部手术过程中切除的左前颞叶的脑组织，该组织约半粒米大小。样品经由固定、染色、包埋后，使用自动化磁带收集超微切片机（automatictape-collecting ultramicrotome, ATUM）对其进行切片，共收集5019个组织切片，平均切片厚度为33.9nm，样品总厚度为0.170mm。随后，这些切片被放置在硅晶片上，在一个定制的61束平行扫描电子显微镜下以4*4nm²的分辨率对大脑组织成像，快速获取图像，总成像体积为1.05mm³。每个切片的原始数据大小高达350千兆，原始数据集大小高达1.4PB。

随之而来的是对如此庞大的数据进行分析所带来的计算挑战。研究人员利用人工智能算法成功解决了这一问题。研究团队通过计算将这些数据拼接（stitch）和对齐（align）产生一个单一的3D体积。虽然数据的质量总体上非常好，但这些对齐通道必须强健，才能应对一些挑战，包括成像伪影（imaging artifacts）、缺失部分、显微镜参数的变化以及组织的物理拉伸和压缩等问题。一旦对齐，一个使用了数以千计的谷歌云TPU、多尺度的FNN算法就会被应用于生成组织中每个单独细胞的3D分割。FFN是第一种自动分割技术，能够产生足够精确的重建。此外，其他的机器学习管道被用来识别和描述1.3亿个突触，将每个3D片段分成不同的“子区域”（例如轴突、树突或细胞体），并识别其他感兴趣的结构，例如髓磷脂和纤毛。

然而，自动重建的结果并不完美。由于神经元结构数据量庞大，仅靠单个实验室的成员对整个数据集进行人工校对是不现实的。因此，普林斯顿大学和艾伦研究所的研究人员开发了一个在线校对平台CAVE（Con-nectome Annotation and Versioning Engine），作为 Neuroglancer 的扩展。该平台允许用户校对和更新带注释的数据，以改进数据集，作为他们自己研究的一部分。研究人员可以选择特定的神经元或它们的连接，并手动改进和注释它们的重建。CAVE已经可以用于较小的数据集，包括苍蝇连接体。

但在这项工作中，研究人员更新了算法，以便能够处理这种大小的数据集。该接口允许的校对是完成连接体重建的关键最后一步。任何人都可以申请成为校对员，校对员可以下载与他们所校对的单元格相关的数据以供后续分析。此外，VAST（Volume Annotation and Segmentation Tool）作为一个通用的免费软件也可用于查看、分割和注释大型数据集。为了进行多样化的分析，研究人员还提供了各种数据库，使得使用者可以对细胞和突触数据进行特定查询。为了支持复杂的查询条件，研究人员开发了一个独立程序CREST（Connectome Reconstruction and Exploration Simple Tool），该程序可根据细胞的许多特征来识别和探索细胞之间的连接。

人类大脑皮层的细胞与突触的构成

通过对样品中所有有核细胞的鉴定与定量分析，共识别出49080个神经元与胶质细胞，还有8100个血管相关细胞。胶质细胞数量（32315）约为神经元数量（16087）的2倍。这些神经元主要分为多棘型（spiny，占65.5%）、无棘型（nonspiny）和非锥体型（nonpyramidal）。人脑皮层神经元的密度约为16000/mm³，这一密度比先前通过人类颞叶皮层的光学显微镜估计的密度低约三分之一，比小鼠联合皮层的密度低近10倍。

根据细胞胞体大小与分布密度，研究人员将样本划分成了6层皮质层以及白质。其中，胶质细胞在各层之间的分布表现出差异（图2）。特别的是，原生质星形胶质细胞（protoplasmic astrocytes）在第2层至第6层密集分布。然而，在第一层较浅的部分，它们往往更混杂，密度更高，尺寸更小。白质中的纤维状星形胶质细胞比占据皮层的纤维状星形胶质细胞更细长。另外两种胶质细胞，小胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞（OPCs），在所有层中几乎具有均匀的密度。另一种胶质细胞，少突胶质细胞(n=20,139)则按梯度分布，上层密度最低，白质密度最高，这可能与他们在髓磷脂形成中的作用有关。小胶质细胞、OPCs和少突胶质细胞均对血管具有亲和力。大量髓鞘轴突呈放射状分布在白质和浅层皮质层之间，水平分布在两个正交轴上。重建的血管在分布上没有表现出层特异性。

突触，是神经网络的桥梁。人类大脑有860亿个神经元，因为有了突触，才可以把神经元上的电信号传递到下一个神经元。接下来，为了识别突触位点，研究人员训练了一个基于U-Net架构的分类器来标记三个类别：背景、突触前和突触后。研究人员还训练了一个两类 ResNet-50分类器，根据其电子显微镜外观、突触后结构类型和突触前神经元类型（如果已知）将每个识别的突触分类为兴奋性或抑制性。

在整个重构的人脑组织中，约1.025亿个（67.1%）突触为兴奋性突触，约5030万个（32.9%）突触为抑制性突触（图2）。进一步分析表明，这些突触大多数位于树突上（99.4%），只有极少部分支配轴突起始部分（0.197%）或胞体（0.394%）。这些数据可以在Neuroglancer平台获取。通过对重建的突触进行分析，研究人员发现兴奋性突触主要分布在第1层与第3层，抑制性突触主要分布在第1层。此外，锥体神经元和中间神经元接收的兴奋性与抑制性输入比例在各层稍有不同，从中可见神经网络的复杂调控机制。

▷图2：人类大脑皮层细胞与突触在大脑皮层与白质的分布

第六层三角形神经元的形态学亚类

大脑皮层深层区域，由于其细胞类型复杂多样，人们对于它的了解并不如大脑皮层浅层区域深入。在该研究中，研究人员着重研究了大脑皮层深层区域的多棘神经元（spiny neurons），特别是在灵长类动物中未被充分理解的三角形神经元（triangular neurons）。在重建的人脑组织中，三角形神经元大部分位于第5层和第6层（n = 876），约占多棘神经元的三分之一。这些细胞的显著特征是它们的大型基底树突从胞体中向不同方向伸展，形成了显著的方向性分布，因此也被称为“指南针神经元”（compass neurons）。

研究进一步区分了基底树突向前和向后延伸的两类神经元，一类大基底树突向样本的一边倾斜，另一类是大基底树突以镜像对称的角度向另一边倾斜。这两组细胞在大脑白质中形成了镜像对称的分布（图3）。此外，基底树突的方向表现出双峰分布，大部分细胞要么显著向前，要么明显向后，而其他的基底树突更偏向切向。这些基底树突的分布与大脑皮层的功能区域相对应，可能与下位白质的肌腱鞘轴突的主轴有关。这些神经元倾向于与方向相同的最近邻细胞聚集，表明这种空间分布并非偶然。这些镜像神经元的统计相关性表明，这种细胞类群聚集可能具有一些潜在的、目前还不清楚的功能。

▷图3：人类大脑皮层深层三角形神经元的两个镜像对称亚群

多突触连接

以往的研究表明，啮齿动物大脑皮层的轴突偶尔会在同一个突触后细胞上形成多个突触连接。为了研究人类大脑皮层中是否存在同样的现象，研究人员使用CREST系统地识别了重建人脑组织中的强连接。结果表明，人类大脑皮层中，单个轴突也偶尔会在同一突触后细胞上建立多个突触。研究人员系统地发现了这种现象，包括兴奋性和抑制性轴突，但这类强连接非常罕见但极其强大，一对神经元之间可能存在超过50个单独的突触连接。在轴突和目标细胞之间，96.5%的接触通常只有一个突触，而 0.092%的轴突连接可存在四个或更多的突触。

此外，对2743个神经元的分析显示，39%的神经元在其树突上至少有一个输入包含七个或更多突触，这表明强大的轴突输入是人类大脑神经元的一个普遍特征。有趣的是，这些多突触联系通常是由轴突与树突在较长距离内保持密切接触而形成的（图4）。

作者还探讨了轴突与目标细胞之间建立的突触数量是否超过随机模型的预期，结果显示，与模型预测相比，实际观察到的强连接发生率显著较高（图4）。尽管人类大脑皮层中单个轴突在同一突触后细胞上建立多个突触的现象不常见，但这种稀有的、强大的连接可能是神经元间复杂通信的重要组成部分。

▷图4：人类大脑皮层异常强大的突触连接。

利用纳米级分辨率探索人脑六层皮层结构，研究人员在细胞至亚细胞级别揭示脑组织的细节，研究神经元、突触、神经胶质和血管之间的复杂关系。此外，作者提供了几种软件工具，如基于浏览器的Neuroglancer，及其派生工具CREST和CAVE，以及VAST，极大地促进了数据的可视化和注释。

然而，该研究也存在一定的局限性。一方面，健康个体的新鲜样本不太可能通过这种神经外科途径获得；另一方面，尽管该患者的颞叶在光镜下没有显示出实质性的病理变化，但长期癫痫或其药物治疗可能对皮质组织的连通性或结构有一些更微妙的影响。

在这个组织中发现了一些奇怪的特征，包括一些非常大的刺，充满不寻常物质的轴突变异，以及少数轴突形成广泛的“轴突螺旋”。目前，我们无法确定这些罕见结构是否与疾病或治疗药物有关，或是人类大脑的共同特征。比较从患有不同潜在疾病的个体获得的样本将有助于更好地理解这些现象。此外，由于人脑皮层的结构一定程度上依赖过往经验，这就意味着人与人之间的皮层结构存在一定差异，但这个差异有多大我们尚未知晓。

考虑到人类经验、行为和遗传的更大变异性，以及人类和其他脊椎动物拥有大量已识别的神经元类别，而不是单个已识别的神经元类型，比较人类大脑之间的神经环路可能更具挑战性。

参考文献：

[1] Januszewski, Michal, Kornfeld, et al. High-precision automated reconstruction of neurons with flood-filling networks. Nat. Methods, 2018

[2] Dorkenwald, S., Li, P.H., Januszewski, M. et al. Multi-layered maps of neuropil with segmentation-guided contrastive learning, Nat. Methods, 2023

[3] https://google.github.io/tensorstore.

[4] Li, P. H., Lindsey, L. F., Januszewski, M., et al., Automated reconstruction of a serial-section EM Drosophila brain with flood-filling networks and local realignment, bioRxiv, 2019

[5] C. S. Xu, M. Januszewski, Z. Lu, S.-y. Takemura, K. J. Hayworth, G. Huang, et al., A Connectome of the Adult Drosophila Central Brain, bioRxiv, 2020